Pubblicato il Report 2015 sull'attività di ricerca finanziato da Fondazione Ginevra Caltagirone

La linea di ricerca sviluppata nel 2015 da parte del Dott. Masetti si inserisce all'interno di una progettualità più ampia già iniziata nel 2012, grazie al sostegno di Fondazione Caltagirone, incentrata sul sequenziamento massivo del genoma di pazienti pediatrici affetti da Leucemia Acuta Mieloide, una malattia ancora oggi estremamente aggressiva e gravata da una sopravvivenza libera da malattia a 5 anni ancora non superiore al 65%.

L'obiettivo, come già spiegato in precedenza, è quello triplice di:

1) identificare nuovi marcatori molecolari per la diagnosi ed il monitoraggio della malattia,

2) comprendere il comportamento biologico della malattia e la sua evoluzione,

3) identificare bersagli molecolari che possano essere suscettibili di un trattamento biologico mirato integrato alla chemioterapia convenzionale.

I primi anni del progetto si sono prevalentemente concentrati sul primo punto. Sono state individuate mutazioni in geni che regolano la proliferazione cellulare e la morte cellulare, in geni che codificano per enzimi che servono al DNA per dividersi, e altri che servono per trascrivere il DNA, in sottogruppi di LAM a prognosi particolarmente sfavorevole.

L'ultimo gene di fusione identificato nel 2015 è quello che risulta dai geni NUP98 e PHF23 ed stato pubblicato sulla rivista Journal of Hematology and Oncology. Per la prima volta viene dimostrata la ricorrenza in circa il 3% di tutte le LAM a cariotipo normale di questo gene di fusione.

Nel 2015, oltre ad aver prodotto questo importante risultato nell'identificazione di nuovi marcatori, sono stati raggiunti significativi risultati anche riguardo alla comprensione del comportamento biologico della malattia e alla sperimentazione di nuovi agenti farmacologici indirizzati a bersagli molecolari specifici della malattia.

Il sequenziamento massivo dell'esoma delle condizioni di esordio, remissione e recidiva di quattro pazienti pediatrici affetti da LAM a cariotipo normale ha permesso di individuare in ciascuno mutazioni presenti soltanto all'esordio, soltanto alla recidiva e mutazioni presenti in entrambi i campioni dello stesso paziente. Questi risultati confermano una natura eminentemente policlonale della LAM pediatrica, estendendo la validità del modello di evoluzione clonale della malattia, già convalidato da Ding et al per la LAM dell'adulto. Si configura così l'evidenza di una complessità genomica notevolmente superiore a quanto ritenuto in passato. In particolare, mentre uno o pochi eventi mutazionali sono inizialmente responsabili della trasformazione leucemica (eventi primari), in seguito la popolazione neoplastica si differenzia in subcloni tramite l'acquisizione di mutazioni aggiuntive (eventi secondari). L'evoluzione della malattia è poi il risultato dell'interazione dinamica dell'effetto di tali mutazioni con il microambiente e le terapie a cui viene sottoposto il paziente.

Tra gli eventi secondari evidenziati in uno dei pazienti analizzati, si annoverano la mutazione A72V di PTPN11, che compare alla recidiva nel 64% della popolazione blastica, e la mutazione D835E di FLT3 riscontrata in una piccolo clone (6%) all'esordio che va incontro ad espansione alla recidiva (26%). Tali eventi, notoriamente associati ad un aumento dei segnali proliferativi cellulari, nonostante appaiano non determinanti nell'insorgenza della malattia, certamente ne favoriscono la perpetuazione e sopravvivenza alle terapie tradizionali.

Alla luce della disponibilità di inibitori farmacologici specifici, si evidenzia la necessità di caratterizzare dal punto di vista molecolare la malattia non soltanto all'esordio, come viene praticato abitudinariamente, ma anche alla recidiva, per poter utilizzare una terapia individualizzata, proprio in seguito al fallimento delle terapie tradizionali.

Anche le mutazioni di WT1, un fattore di trascrizione particolarmente espresso nelle cellule leucemiche e mutato in circa il 10% delle LAM, si sono rivelate altamente instabili durante il decorso di malattia, sia in termini di acquisizione che di perdita, rispecchiando il ruolo non primario ed ancora oscuro di tali eventi nella patogenesi della LAM. Al contrario, la mutazione di CEBPA, un fattore di trascrizione mutato nel 4.5% delle LAM pediatriche, è presente in omozigosi nella totalità della popolazione leucemica sia all'esordio che alla recidiva di uno dei pazienti analizzati, in accordo con il ruolo primario attribuito a tale evento tanto che la LAM con mutazione biallelica di CEBPA è inserita come entità provvisoria nella classificazione WHO delle LAM.

Altri eventi molecolari da noi individuati come possibile contributo alla recidiva di malattia, comprendono una mutazione della tirosin chinasi TYK2, associata ad un aumentata resistenza all'apoptosi, e una mutazione di SETD2, una metiltrasferasi implicata nel mismatch repair la cui inattivazione è associata ad un accumulo di mutazioni somatiche, meccanismo in grado di aumentare ulteriormente la complessità genomica della malattia e favorirne la plasticità e quindi la sopravvivenza alle terapie.

Il farmaco usato nello studio finanziato è il GANT61 un inibitore delle proteine della famiglia GLI usato in preclinica in alcuni tumori solidi come neuroblastoma in cui è attivo in modo anomalo il pathway di Hedgehog.

Durante i primi quattro mesi l' attività di ricerca si è focalizzata prima di tutto nel ricercare modelli preclinici idonei per testare l'efficacia del farmaco. In questo caso sono state scelte due linee cellulari: le M07 e le WSU-AML concesse dal St. Jude Children's Research Hospital, Memphis oltre a una serie di linee cellulari di LAM negativi per il gene di fusione CBFA2T3-GLIS2.

Le linee cellulari positive e negative alla traslocazione in esame sono state trattate per 72h con l' inibitore del pathway di Hedgeogh, il GANT61. Sono state testate 8 concentrazioni del farmaco da cui si è ricavata la dose media che uccide il 50% delle cellule (IC50). Dall'analisi statistica è emerso che le linee cellulari positive alla traslocazione di GLIS2 sono più sensibili al trattamento con il GANT61 rispetto alle altre linee di LAM negative (Figura 1A).

Questo è stato un importante risultato perché ha già dato una prima idea sul meccanismo di azione del farmaco che agisce in qualche modo specificatamente sul target scelto (in questo caso GLIS2 che è indispensabile per il processo di leucemiogenesi) e nello stesso tempo la tossicità aspecifica è bassa per le altre linee cellulari in cui non è presente la stessa traslocazione dello stesso GLIS2.

Nello stesso modo trattando con il farmaco le stesse linee cellulari con traslocazione del gene GLIS2 è stato condotto uno studio di espressione genica allo scopo di determinare l'effetto farmacologico sull'attività trascrizionale mediata da GLIS2. Le due linee sono state trattate con GANT61 per 48h, è stato quindi estratto l'RNA totale della cellula ed è stata quantificata l'espressione genica attraverso piattaforma affymetrix. Dall'analisi dei dati è stato confermata l'attivazione di alcuni geni specifici della via di segnalazione di Hedgeogh come BMP2, GATA3, CCND2 o NCAM1 citati in due studi precedenti, alcuni dei quali subisce un'evidente calo dell'espressione in seguito al trattamento farmacologico. Però oltre a questi geni l'analisi statistica dei dati ha evidenziato per la prima volta l'espressione di altri geni con importanti funzioni all'interno della cellula neoplastica. Fra questi alcuni intervengono nei processi di regolazione della proliferazione (kIF14, MELK, MCM10, NUF2), regolazione del ciclo cellulare (CCNA2, CDKN3, CDC7, PRC1), riparazione (BRCA1, BRCA2) e soprattutto geni che intervengono in processi epigenetici come metilazione del DNA (DNMT1, DNMT3B).

Tutti questi geni subiscono un calo statisticamente significativo in seguito al trattamento con GANT61.

Questo è un risultato molto interessante in quanto aiuta a capire meglio la biologia tumorale di questo sottogruppo di LAM. Il calo dell'espressione di tutti questi geni dopo trattamento con GANT61 rafforza l'ipotesi che il farmaco è specifico per l'aberrazione in esame e soprattutto potrebbe rappresentare un trattamento di prima linea nella cura di questo sottogruppo di LAM a prognosi infausta. Inoltre dato che il farmaco agisce negativamente sull'espressione di geni coinvolti nei meccanismi di riparo del DNA, il GANT61 potrebbe potenziare l'effetto dei chemioterapici tradizionali usati oggi nei protocolli terapeutici.

Figura 1. A) IC50 delle Linee cellulari positive e negative alla fusione CBFA2T3-GLIS2 : come si può vedere le linee cellulari con aberrazione CBFA2T3-GLIS2 hanno un'IC50 statisticamente più bassa rispetto a tutte le altre linee negative per la stessa traslocazione.